激光熒光共聚焦顯微鏡的工作原理

背景

激光熒光共聚焦顯微鏡（CLSM）是近代先進(jìn)的細(xì)胞生物分析/儀器之一。是在1957年，Marvin Minsky首先提出這一概念，經(jīng)過多年的發(fā)展才實現(xiàn)顯微鏡所需要的激光束掃描技術(shù)，點對點掃描構(gòu)建二維圖像以及到后期根據(jù)多張二維光學(xué)圖像構(gòu)建三維圖像。激光共聚焦顯微鏡是在熒光成像的基礎(chǔ)上加裝激光，激光掃描器，針孔等裝置，使用可見光激光熒光探針結(jié)合計算機(jī)進(jìn)行圖像處理，不僅可以觀察固定的細(xì)胞，組織切片還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，分子，離子進(jìn)行實時動態(tài)地觀察和檢測。

工作原理

下圖所示為激光熒光共聚焦顯微鏡的光路圖，輸出激光通過照明針孔再經(jīng)由分色鏡反射到物鏡，最后聚焦到樣品表面，激光會與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光，部分熒光信號會沿著入射光路相反方向通過物鏡后進(jìn)入二向色鏡（Beam Splitter），最終被探測器收集。由于針孔與樣品的焦平面處形成共軛關(guān)系，所以焦平面以外的反射信號會被針孔濾除，使得共聚焦顯微鏡具有一定的層析能力。經(jīng)過針孔后的熒光信號具有較強(qiáng)的層析能力，同時由于光強(qiáng)較弱，需要使用靈敏度較高的光電探測器進(jìn)行探測。光電倍增管可以將熒光信號放大并轉(zhuǎn)換為電信號（光電探測器輸出的電信號強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成正比）然后傳輸給電腦，電腦通過特定的處理方法將電信號轉(zhuǎn)換成圖像信息。

共聚焦顯微鏡的構(gòu)成

激光器（Laser）

配置四條激光通道（405nm，488nm，561nm，638nm，波長可選）

二向色鏡（Dichromatic）

二向色鏡作為一個濾光片（Filter）可將熒光中摻雜的激光分離出來，以便于熒光的后續(xù)處理。

XY掃描鏡組（Scanner）

由一個或多個反射鏡組成的鏡組，用于引導(dǎo)聚焦后的激光在樣本上進(jìn)行點對點（Pixel-by- pixel）和行對行（Line- to- line）的掃描。

針孔（Pinhole）

用于提高共聚焦顯微鏡的層析能力，可濾除焦點以外的熒光信號。

應(yīng)用

如下圖所示，使用激光共聚焦顯微鏡對花粉進(jìn)行3D成像，激發(fā)光源為488納米激光，通過將一張張光學(xué)切片按順序重構(gòu)可以得到下圖所示的三維圖像。

Time Lapse(延時功能）